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小鼠Th1/Th2和Tc1/Tc2的检测

作者:联科生物????发布日期:2018-12-13 09:00


1.检测原理


小鼠 Th1/Th2 细胞及 Tc1/Tc2 细胞与人的相似,均可分泌多种细胞因子:

Th1 细胞主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ和 TNF-β等;

Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10


与人相同,鉴别 Th1/Th2 及 Tc1/Tc2 同样采用下面的组合:

Th1:CD4+IFN-γ+,

Th2:CD4+IL-4+

Tc1:CD8+IFN-γ+,

Tc2:CD8+IL-4+

刺激素也是我们通常选用的为 PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。


与人 Th1/Th2 和 Tc1/Tc2 不同的是,小鼠淋巴细胞在 PMA 和 Ionomycin 的刺激下,其表面的 CD4 抗原下降不明显,因此可以用 CD4 和 CD8 的抗体直接设门分析 Th1/Th2 及 Tc1/Tc2。但如果同时想得到Th1/Th2 及 Tc1/Tc2 的数据,也可采用 CD3 和 CD8 反设门法,即 CD3+CD8+代表 Tc,CD3+CD8-代表 Th,在此基础上得到 IFN-γ和 IL-4 表达的百分率。


2. 检测方法


【试剂】 

PMA、 Ionomycin、BFA(Brefeldin A)、Monensin 和 RPMI1640 的配制与人 Th1/Th2 和 Tc1/Tc2 检测相同,详见第三部分的检测方法。


【抗体和破膜剂】

?? 抗体

供应商 产品名称 货号 亚型
MultiSciences Anti-Mouse CD3e (145-2C11), PerCP-Cy5.5 70-AM003E07-250 Armenian Hamster IgG
MultiSciences Anti-Mouse CD8a (53-6.7), FITC 70-AM008A01-250 Rat IgG2a, κ
MultiSciences Anti-Mouse IFN-γ (XMG1.2), PE 70-AM0IF04-250 Rat IgG1, κ
MultiSciences Anti-Mouse IL-4 (11B11), PE 70-AM0I404-250 Rat IgG1, κ


?? 同型对照

供应商 产品名称 货号 对应抗体
MultiSciences Rat IgG1 Isotype Control (HPPN), PE 70-CRG104-50 ?IFN-γ、IL-4

?

?? 破膜剂

供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences FIX&PERM Kit 70-GAS006 200T


【抗体组合】

?? 三色法

管号 FITC PE PE-Cy5 注释
1 CD8 Rat IgG1 CD3 第 2,3 管的同型对照
2 CD8 IFN-γ CD3 CD3+CD8- IFN-γ+为 Th1 细胞
CD3+CD8+ IFN-γ+为 Tc1 细胞
3 CD8 IL-4 CD3 CD3+CD8- IL-4+为 Th2 细胞
CD3+CD8+ IL-4+为 Tc2 细胞


【实验步骤】 


?? 1.标本采集及制备


A. 血液标本

小鼠血液标本一般采用眼眶后静脉丛采血法,因此法不需麻醉或处死小鼠,对小鼠的伤害小,且可重复采血,具体方法如下:

1)穿刺采用一根特制的长 7~10cm硬的玻璃取血管,其一端内径为 1 ~1.5m,另一端逐渐扩大,细端长约 1cm 即可,将取血管浸入 1%肝素溶液,干燥后使用;

2)采血时,左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定,并轻轻压迫颈部两侧,阻碍静脉回流,使眼球充分外突,提示眼眶后静脉丛冲血;

3)右手持取血管,将其尖端插入内眼角与眼球之间,轻轻向眼底方向刺入,当感到有阻力时即停止刺入,旋转取血管以切开静脉丛,血液即流入取血管中;

4)采血结束后,拔出取血管,放松左手,出血即停止。

注:

1)用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2~0.3ml;

2)为适用于 Th1/Th2 及 Tc1/Tc2 检测,需用肝素钠来处理取血管,不可用肝素锂、EDTA 或枸橼酸钠。


B. 脾单细胞悬液的制备

脾单细胞悬液的制备通常有两种方法,可依据自己的喜好及习惯来选择。

1) 研磨法

? 小鼠用 CO2 处死,立即无菌取脾;

? 将脾浸入装有冷 PBS 的培养皿中,用钝头剪刀剪去白色的结缔组织,换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏;

? 再次换入一个装有冷 PBS 的培养皿中;

? 用小的弯头手术剪剪切脾脏成 3mm3 左右的小块;

? 用 5ml 或 10ml 塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压研磨脾脏小块,此时会看到很多脾单细胞进入 PBS 中。对于一只 30 克左右的小鼠,完全研磨脾脏后约可获得 100 x 106 左右的细胞;

? 经 200 目筛网过滤获得单细胞悬液,用冷 PBS 洗涤 2 次,每次 1000r/min, 离心 10 分钟;

? 将细胞悬浮于 RPMI 1640(含 10%热灭活FBS)中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上);

? 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml。

2) 穿刺法

? 小鼠用 CO2 处死,立即无菌取脾;

? 将脾浸入装有冷 PBS 的培养皿中,用钝头剪刀剪去白色的结缔组织,换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏;

? 用 10ml 注射器的针头在脾脏表面密密麻麻穿刺;

? 用针头吸取培养皿中的 PBS,用力注入脾脏中,细胞即会从小孔中流出;

? 彻底冲出脾细胞内的细胞,用玻璃吸管吸取细胞悬液;

? 经 200 目筛网过滤获得单细胞悬液,用冷 PBS 洗涤 2 次,每次 1000r/min, 离心 10 分钟;

? 将细胞悬浮于 RPMI 1640(含 10%热灭活FBS)中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上);

? 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml。


C. 淋巴结单细胞悬液的制备

? 小鼠用 CO2 处死,立即无菌取出腋下和腹股沟淋巴结;

? 将淋巴结浸入装有冷 PBS 的培养皿中,用钝头剪刀剪去脂肪组织,换入另一个装有冷 PBS 的培养皿中以清洗脾脏;

? 再次换入一个装有冷 PBS 的培养皿中;

? 用小的手术剪剪切淋巴结成 3-4mm 大小的小块;

? 在培养皿中放置一个孔径为 20um 的筛网,用 5ml 或 10ml 塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压小块,使得淋巴结的单细胞通过筛网进入其下面的 PBS 液中;

? 用冷 PBS 洗涤 2 次,每次 1000r/min, 离心 10 分钟;

? 将细胞悬浮于 RPMI 1640(含 10%热灭活FBS)中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上);

? 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml。


??2.刺激及检测(简易的三色法)


1) 全血标本:取 45ul 全血标本于试管中,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS)稀释至 300ul;

PBMC 标本:取 300ul PBMC(2 x 106 细胞/ml)于试管中

2) 加入 7.5μl 1μg/ml PMA 工作液 + 6μl 50μg/ml Ionomycin 工作液 + 5.1μl 0.1mg/ml Monensin 工作液(或 6μl 0.5mg/ml BFA 工作液),混匀

3) 37 ℃,5% CO2 培养箱培养 4~6 小时。(不能超过 6 个小时)

4) 混匀,加入 5ul CD3e-PerCP-Cy5.5 和 5ul CD8a-FITC, 室温,避光孵育 15 分钟

5) 分成 3 管,每管加入 100μl 已染色的全血, 编号为 A1,A2 和 A3

6) 每管中加入100μl Fix&Perm中的Reagent A(即固定液),室温,避光孵育15分钟

7) 每管中加入 3mL PBS,1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清。(此时需用剩余的些许 PBS 轻轻震荡来重悬细胞,以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)

8) 每管中加入 100μl Fix&Perm 中的 Reagent B(即破膜和溶血液),同时各管中按下表加入相应的抗体:

?
管号 A1 A2 A3
抗体 Rat IgG1-PE IFN-γ IL-4


9)室温,避光孵育15分钟。每管中加入3mL PBS,1200 rpm离心5分钟,弃除上清

10)0.5mL PBS 重悬细胞,上机检测

?

【结果分析】

该结果得自对小鼠脾细胞的 Th1/Th2 和 Tc1/Tc2 的分析。

如图 3A,用 R1 区域选定脾细胞;

如图 3B,设门于 R1,用 R2 区域选定 CD3+T 细胞;

如图 3C,设门于 R1+R2,得出 Th1 和 Tc1 在 CD3+T 细胞中的比例;

如图 3D,设门于 R1+R2,得出 Th2 和 Tc2 在 CD3+T 细胞中的比例;

3:小鼠 Th1/Th2 Tc1/Tc2 的流式分析方法


??3. 其它相关细胞因子的检测


除 IFN-γ?和 IL-4 外,IL-1a、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF1 和 TNF-α等也是 Th1/Th2 或 Tc1/Tc2所分泌的细胞因子,虽然不是非常特异,但在某些疾病中同样发挥着重要的作用,因此也有检测的必要。

检测这些细胞因子时,要注意所用的刺激剂及刺激方法与 IFN-γ?和 IL-4 有所不同,因 PMA+Ionomycin不一定能使这些细胞因子达到最大分泌。所以需参照下表(表 10),根据不同的细胞因子,选择最佳的刺激方法。


表 10:小鼠 Th1/Th2、Tc1/Tc2 相关细胞因子的刺激方法

?
细胞因子 标本类型 刺激时间 再刺激 阻断剂
IL-1a 小鼠 PEC 1) 小鼠 IFN-γ(100ng/ml) 2hr ? Monensin
?
? 小鼠 PEC 2) LPS(100ng/ml) 22hr ?
IL-2 小鼠脾脏 1) ConA(3ug/ml) 2d CD3 抗体
(10ug/ml immobilized)
+
CD28 抗体
(2ug/ml soluble)
?5hr
?

?
? 小鼠脾脏 2) L-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
IL-6 小鼠脾脏 1) ConA(3ug/ml) 2d
? 小鼠脾脏 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
IL-10 小鼠脾脏 1) ConA(3ug/ml) 2d
? 小鼠脾脏 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
IL-12 小鼠 PEC 1)小鼠 IFN-γ(100ng/ml) 2hr ?
IL-12 小鼠 PEC 2) LPS(100ng/ml) 22hr ?
GM-CSF 小鼠脾脏 1) ConA(3ug/ml) 2d CD3 抗体
(10ug/ml immobilized)
CD28 抗体
(2ug/ml soluble)?? 5hr
GM-CSF 小鼠脾脏 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
TNF-α 小鼠脾脏 1) ConA(3ug/ml) 2d
TNF-α 小鼠脾脏 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d


注:PEC: thioglycolate-elicited peritoneal macrophages,巯基乙醇酸钠释放的腹膜举噬细胞;
ConA :刀豆蛋白 A;
LPS:脂多糖;
hr:hour,小时;
d:day,天

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